Després de la perfusió amb crioprotectors, el pacient no es col·loca simplement dins de nitrogen líquid.
El pacient segueix un programa de temperatura controlat per ordinador que dura diversos dies. Els sensors situats a l'interior del pacient indiquen si les diferents regions anatòmiques es refreden de manera uniforme o si apareixen gradients tèrmics perillosos.
El problema d'enginyeria canvia al llarg del descens. El refredament inicial ha de limitar la formació de gel. A prop de la transició vítria i per sota d'aquesta, la precisió i la uniformitat tèrmica esdevenen més importants que la velocitat.
Per què cal un refredament controlat
Els agents crioprotectors redueixen la velocitat de refredament necessària per evitar la formació de gel. Permeten que els teixits rics en aigua assoleixin un estat vitri molt viscós, en lloc de formar cristalls de gel de manera generalitzada.
La temperatura de transició vítria pertinent, indicada amb Tg, depèn de la solució, de la concentració i del mètode de mesura. És un interval, no un llindar biològic universal.
En les solucions rellevants per a la criopreservació humana, aquest interval se situa habitualment entre -120°C i -135°C.
Per sobre d'aquest interval, un refredament massa lent pot permetre la nucleació i el creixement de gel. Per sota, el material es comporta cada cop més com un sòlid fràgil.
Si la superfície es refreda molt més ràpid que el centre, les diferents regions es contrauen en graus diferents. La tensió termomecànica resultant pot provocar esquerdes.
Això obliga a seguir un marge operatiu estret: cal refredar prou de pressa abans de la vitrificació i, després, controlar els gradients i la velocitat de refredament quan el material entra en estat vitri.
Consulteu la diferència entre congelació i vitrificació per entendre els canvis de fase implicats.
La caixa de refredament de primera generació
El sistema de primera generació de Tomorrow.bio, anomenat caixa de refredament V1, va establir l'arquitectura bàsica per al refredament controlat de tot el cos.
El pacient es col·loca en una cambra aïllada destinada específicament a aquest procés. Un ordinador controla l'entorn criogènic de la cambra mentre termoparells mesuren la temperatura en diversos punts.
El controlador segueix una corba programada en lloc d'aplicar un refredament màxim de manera contínua. Les dades de cada sensor queden registrades com a part de l'historial tèrmic del pacient.
Això ja és fonamentalment diferent de la immersió directa. El sistema pot alentir el refredament, mantenir-lo estable o modificar les condicions de la cambra segons la resposta tèrmica real del pacient.
El sistema de segona generació basat en recipient Dewar
El disseny de segona generació de Tomorrow.bio incorpora el refredament controlat en un recipient Dewar dissenyat específicament per a aquesta funció.
El pacient roman dins del recipient Dewar, mentre una tapa especialitzada integra l'equip de refredament, els controls informàtics, les vàlvules, les connexions dels sensors i els passos estancs dels termoparells.
Els termoparells es col·loquen en diversos punts a l'interior del pacient. Sensors addicionals monitoren l'entorn tèrmic dins del recipient Dewar.
Per tant, el sistema no es limita al valor de consigna establert. També permet observar a quina velocitat responen les diferents regions del pacient que es mesuren.
L'ordinador ajusta el gradient de temperatura i la velocitat de descens del recipient Dewar per mantenir les lectures dins dels marges previstos pel protocol.
Un cos gran no pot ser perfectament isotèrmic durant el refredament. L'objectiu pràctic és minimitzar la dispersió i evitar que cap regió mesurada s'avanci o s'endarrereixi de manera perillosa.
La geometria del recipient Dewar també redueix les manipulacions necessàries entre el refredament controlat i l'emmagatzematge criogènic. Aquest recinte tancat pot proporcionar un entorn estable i tèrmicament simètric al voltant del pacient.
La temperatura de consigna no és la temperatura del pacient
Un controlador pot refredar l'entorn ràpidament. No pot fer que el centre d'un cos humà arribi de manera instantània a aquella mateixa temperatura.
La calor s'ha de transferir des dels teixits més profunds cap a la superfície. La geometria corporal, la composició del cos, la distribució dels crioprotectors i la posició dels sensors influeixen en el retard observat.
Per això un únic sensor a la cambra no és suficient. Un entorn nominal de -130°C no demostra que totes les parts mesurades del pacient hagin arribat a -130°C.
El sistema de control ha de tenir en compte tant la temperatura absoluta com la diferència entre canals. El punt que es refreda més lentament, el que es refreda més de pressa i la dispersió global aporten informació complementària.
També importen la calibració, la col·locació i la continuïtat dels termoparells. Les lectures inversemblants o les fallades dels sensors s'han d'assenyalar, i no pas incorporar-les sense més com si fossin una mitjana dins de la corba.
El programa de temperatura en tres etapes de Tomorrow.bio
El protocol actual té tres fases diferenciades. Aquests valors són objectius operatius d'aquest equip i d'aquest mètode crioprotector, i no constants universals aplicables a qualsevol sistema de vitrificació.
1. Descens ràpid cap als -130°C
La primera fase porta el pacient des de la temperatura del gel sec fins a aproximadament -130°C tan de pressa com permeti, amb seguretat, la dispersió de temperatura mesurada.
Aquí la velocitat compta perquè les regions insuficientment protegides encara poden formar gel abans que el teixit esdevingui vitri.
L'ordinador no es guia només pel temps transcorregut. Vigila els termoparells i ajusta l'entorn de refredament al voltant del pacient.
2. Un escalfament controlat fins a aproximadament -120°C
Un cop assolits aproximadament -130°C, es redueix el refredament actiu i es deixa que el pacient s'escalfi naturalment fins a aproximadament -120°C.
Aquesta és una fase de recuit. A prop de la Tg, el material crioprotegit conserva prou mobilitat molecular perquè part de la tensió mecànica acumulada es relaxi.
Aquest escalfament també dona temps perquè les regions més càlides i les més fredes convergeixin abans que el material passi a un estat vitri més rígid.
El recuit no pot revertir el dany biològic previ. El seu propòsit és més limitat: reduir els gradients tèrmics i les tensions creades per una contracció desigual.
3. Descens fins als -196°C a aproximadament 1°C per hora
A partir d'uns -120°C, l'objectiu és reduir la temperatura aproximadament 1°C per hora fins que el pacient arribi a la temperatura del nitrogen líquid.
Aquest interval final de 76 graus dura uns tres dies, encara sense comptar les pauses i els ajustaments del control.
Mantenir un descens d'1°C per hora en un cos gran i tèrmicament heterogeni és un problema de control, i no pas una simple qüestió d'ajustar un temporitzador.
El sistema de control ha d'ajustar contínuament l'entorn del recipient Dewar perquè les temperatures registrades pels termoparells interns baixin de manera coordinada, sense crear gradients excessius.
Quan una regió s'endarrereix, refredar més l'entorn pot fer que una altra regió es refredi en excés. La precisió consisteix a equilibrar tot el conjunt de sensors, no a perseguir una sola lectura.
Per què la fase de recuit és científicament plausible
La recerca sobre la vitrificació a gran escala identifica dos riscos oposats: un refredament insuficient per sobre de la Tg i una tensió mecànica excessiva al voltant de la Tg i per sota d'aquesta temperatura.
Un estudi de vitrificació a escala d'òrgan humà de 2024 va utilitzar diverses sondes internes i va concloure que el recuit redueix els gradients abans que el material entri en estat vitri.
El mateix estudi va constatar que un refredament lent per sota de la zona de recuit ajuda a evitar que es tornin a acumular gradients i tensions elevats.
Una recerca termomecànica independent va constatar que el recuit prop de la Tg modifica substancialment la tensió residual i en redueix la dependència de la velocitat de refredament prèvia.
Aquests estudis donen suport a l'estratègia de control descrita. No validen de manera independent cada valor de consigna exacte del protocol de tot el cos de Tomorrow.bio.
Els cossos humans sencers són més grans i més heterogenis que les solucions o els òrgans de laboratori. Per això, continuen sent necessaris els registres directes de temperatura i les imatges obtingudes després del refredament.
Què registra l'ordinador
El resultat útil no és un missatge que digui «refredament completat». És la sèrie temporal completa de cada canal de temperatura.
El registre ha de mostrar velocitats, pauses, rebots, gradients entre sensors, accions del controlador, alarmes i qualsevol desviació respecte de la corba prevista.
Aquestes dades formen part de l'avaluació de qualitat de la criopreservació.
Després del refredament, una tomografia computada estandarditzada a la temperatura del nitrogen líquid pot detectar la distribució dels crioprotectors, la presència de gel, deformacions greus i fractures que les dades de temperatura, per si soles, no poden revelar.
Per què s'acaba a la temperatura del nitrogen líquid
A pressió atmosfèrica normal, el nitrogen bull a prop de 77,34 kelvin, aproximadament -195,8°C, segons el NIST Chemistry WebBook.
L'emmagatzematge en nitrogen líquid és passiu. Mentre hi hagi prou líquid al recipient, el seu equilibri d'ebullició manté un entorn criogènic estable sense refrigeració mecànica.
El descens controlat només acaba quan el pacient està tèrmicament a punt per aquest estat estable. L'emmagatzematge no s'utilitza com a substitut del refredament.
El disseny i els compromisos tècnics de l'etapa següent s'expliquen a «Els recipients Dewar criogènics moderns i l'emmagatzematge a temperatura intermèdia».
Resum: Tomorrow.bio utilitza un sistema de refredament controlat per ordinador i sensors interns de temperatura. El procés refreda ràpidament fins a prop de la transició vítria, redueix les tensions tèrmiques i després continua lentament fins als -196°C.
Explora aquesta eina pràctica
Fes servir l'eina interactiva per examinar la qüestió d'aquest article.
S'està carregant l'eina interactiva...
Per aprofundir